/cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/11-01.TXT 1- 2:4. le potentiel de membrane 3- 4:considérons une membrane réelle imperméable aux anions mais partiellement perméable aux cations. la pression osmotique fait que a+ migre de 1 vers 2. le compartiment 1 se charge négativement (perte de a+) et le compartiment 2 se charge positivement créant ainsi un potentiel électrique appelé potentiel de membrane qui s oppose à la migration de a+. 5- /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/11-02.TXT 4- 5:un gradient de concentration d un même ion séparé par une membrane produit un potentiel de membrane. par exemple, les pompes biologiques à potassium et à sodium maintiennent en permanence des gradients de concentration opposés pour ces deux ions. 6- -- 12- 13:la présence du potentiel de membrane permet de stocker ou de restituer de l énergie à partir du gradient des concentrations. en effet, le potentiel électrique est lié à l énergie libre selon : 14- -- 19- 20:la modification du potentiel de membrane lors d un changement du gradient de concentration est caractéristique de la transmission nerveuse. si un gradient de concentration peut produire un potentiel électrique, le contraire est aussi vrai; l application d un potentiel électrique peut provoquer la diffusion d ions. c est l origine de notre sensiblité aux chocs électriques. /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/PDF/12.TXT 1- 2:potentiel de membrane 3-1. introduction -- 20-microélectrode intracellulaire 21:potentiel de membrane au repos 22-on utilise une électrode remplie e kcl poly1 pour un bon contact électrique. 23-on enregistre des différences de potentiels de repos différents selon les cellules. on 24:parle aussi de potentiel de membrane. ce sont des différences de concentrations en 25-ions entre l intérieur et l extérieur de la cellule qui déterminent le potentiel. -- 58-poly4 59:on implante une microélectrode qui va mesurer le potentiel de membrane. il va être comparé 60-à l électrode de référence. 61-on va comparer la tension de la membrane à celle que l on veut mesurer. l amplification va 62:injecter un courant à l aide d une seconde électrode pour amener le potentiel de membrane au 63-potentiel que l on veut. 1- 2:3. dissipation du potentiel de membrane mitochondriale, respiration et fonction contractile 3- 4-la mitochondrie est un élément essentiel de la production d énergie de la cellule cardiaque. dans le muscle cardiaque, plus de 30 % du volume cellulaire est occupé par les mitochondries. grâce au maintien de la phosphorylation oxydative, les mitochondries assurent un perpétuel renouvellement en atp nécessaire aux phénomènes de contraction-relaxation des cardiomyocytes. la production d atp est conditionnée par l activité de l atp synthase ou fof1-atpase, elle-même déterminée par la présence d une force protomotrice générant une différence de potentiel. 5:nous avons montré que les mitochondries isolées de coeurs de rats traités par le lps présentent des anomalies caractérisées par une augmentation de perméabilité, une diminution du potentiel de membrane et une fuite de facteurs pro-apoptotiques, comme le cytochrome c (fauvel et al., 2002). la présence cytosolique de cytochrome c conduit à l activation de la caspase-9, elle-même responsable du clivage et de l activation de la caspase-3. l inhibition pharmacologique de la transition de perméabilité mitochondriale par la cyclosporine permet de prévenir l ensemble de ces phénomènes et améliore la fonction myocardique. ces résultats sont en accord, montrant que la production de tnf-a myocardique conduit à une diminution du potentiel de membrane mitochondrial des cardiomyocytes (favory et al., 2004). 6- -- 9- 10:nous testons actuellement dans le laboratoire l hypothèse selon laquelle la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial des cardiomyocytes est un évènement majeur induit par le lps qui, en plus de fuite mitochondriale de facteurs pro-apoptotiques comme le cytochrome c, est responsable de la défaillance myocardique septique. 11:nous réaliserons des expériences montrant que la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial des cardiomyocytes est responsable d anomalies mitochondriales qui associent une augmentation de perméabilité, un découplage de la chaîne respiratoire, une augmentation de la production de radicaux libres de l oxygène et des anomalies de l homéostasie calcique. 12- 13:a) dans un modèle de péritonite chez la souris, nous étudierons d abord les effets du sepsis sur le potentiel de membrane mitochondrial des cellules cardiaques. la réduction attendue du potentiel de membrane sera associée à des modifications de la respiration mitochondriale qui sera évaluée grâce à un oxygraphe polarographique haute résolution. l ensemble des résultats obtenus permettra de confirmer que la mitochondrie représente une cible importante modulant la réponse à une agression septique. 14- -- 17-c) une étude fonctionnelle sur cardiomyocytes isolés permettra de montrer le bénéfice fonctionnel de l inhibition de la dissipation du potentiel mitochondrial par l utilisation de la cyclosporine et de dérivé non immunosuppresseur, le n-methyl-4-isoleucine csa (nim 811). 18:en effet, dans ce contexte, un traitement par la cyclosporine et le nim 811 administrés immédiatement après l induction de la péritonite chez la souris prévient la baisse de potentiel de membrane mitochondrial et la libération de cytochrome c. 19:le rôle de bcl-2, une protéine mitochondriale qui peut dans certaines conditions s opposer à la baisse de potentiel de membrane mitochondrial et la libération de cytochrome c, sera évalué grâce à l utilisation de souris transgéniques. 20:nous confirmerons l hypothèse que la sur-expression de la protéine anti apoptotique bcl-2 chez la souris transgénique bcl-2 /22 permet de prévenir la baisse de potentiel de membrane mitochondrial, les anomalies contractiles cardiaques et de réduire la mortalité induite par la péritonite. 21- -- 29- 30: le potentiel de membrane mitochondrial sera évalué par l utilisation de tmre, un fluorophore cationique de localisation mitochondriale. la baisse de la fluorescence obtenue avec le tmre témoigne de la baisse de potentiel de membrane mitochondrial ( m) 31- /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/13.TXT /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/PDF/14.TXT 31-fig. 1 – une membrane biologique est composée d une bicouche de lipides dans laquelle baignent les 32:protéines. le potentiel de membrane v est la différence de potentiels électriques entre l interne et l externe. 33-les membranes biologiques et de protéoliposomes sont constituées d une matrice, une bicouche lipidique -- 39- le flux membranaire produit par les pompes est compensé par celui d autres protéines telles que les canaux, les cotransporteurs ou bien encore les uniports. ces protéines sont passives. 40:le résultat de cette activité est la génération d un potentiel de membrane v 41-(v est la différence de potentiels électriques entre l interne et l externe) qui varie suivant le type cellulaire de –30 mv à –250 mv. il existe 42:d autres sources du potentiel de membrane comme le potentiel de donnan ou bien le potentiel de nernst. 43:ce dernier décrit correctement le potentiel de membrane v lorsque la conductance des protéines passives 44-de l un des ions transférés par la pompe est grande devant le courant de la pompe divisé par 45:le potentiel de membrane. c est notamment le cas des les cellules animales dont le potentiel de membrane v est bien 46-représenté par le potentiel de nernst de l ion potassium [5] : -- 50-thermodynamique du potentiel de nernst provient de l équilibre de la différence de concentrations interne 51:et externe par le potentiel de membrane. elle sera explicitée dans la partie 3.1. l objet de ce papier est 52-d étudier la contribution du potentiel de nernst aux propriétés mécaniques de la membrane : figure 2. -- 77-de traverser la membrane. si les densités interne et externe de 1 sont différentes, l ion 1 traverse la membrane 78:et charge donc la capacité que constitue la bicouche électrique. le potentiel de membrane v 79-engendré est la différence entre les potentiels électriques interne fi et externe fe: v=fi-fe. -- 84-où nj8 et nj0 sont les densités ioniques de l ion j loin de la membrane à l extérieur et à l intérieur. vi est le 85:potentiel de membrane tandis que ve est choisi égal à zéro (origine des potentiels). au sein de la membrane, 86-entre r+=r+d/2 et en r-=r-d/2, le potentiel électrostatique satisfait l équation de laplace. /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/15-01.TXT 1- 2:mesure du potentiel de membrane d une cellule oeuf 3- -- 7- 8: mettre en évidence l existence d un potentiel de membrane en mesurant, à l aide de deux électrodes, l une externe, l autre interne, cette différence de potentiel entre les deux faces de la membrane plasmique qui entoure le jaune d un oeuf de poule. 9- -- 52- 53: utiliser un oeuf le plus frais possible pour une bonne amplitude du potentiel de membrane et le porter à température ambiante avant la mesure. 54- /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/15-02.TXT 1- 2:potentiel de membrane d une cellule-oeuf de poule. /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/16.TXT 1- 2:potentiel de membrane : différence de potentiel électrique entre les deux faces de la membrane plasmique d une cellule. le coté interne de la membrane est polarisée négativement par rapport à la face externe. /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/17.TXT 8- 9:on mesure l activité des neurones par des techniques d électrophysiologie principalement par la technique de courant imposé (current-clamp) qui mime mieux les conditions physiologiques normales. pendant un enregistrement électrophysiologique de courant imposé, le voltage (ou potentiel) membranaire du neurone varie librement tandis que le courant est contrôlé par l expérimentateur. faisons un petit rappel : la loi d ohm, u=rxi, affirme que le voltage (u) est le produit de la résistance (r) et du courant (i). rappelons-nous aussi que les canaux ioniques dans la membrane des neurones changent la résistance (r) de la membrane. ainsi, tous changements de résistance de la membrane (dûs à l activité du neurone et ses canaux ioniques), dans des conditions de courant imposé (stable et connu par l expérimentateur), se reflètent en variations de voltage. un enregistrement typique d un neurone est présenté à la première figure. on y voit le potentiel de membrane qui varie selon l activité du neurone. on utilise généralement le terme potentiel, au lieu de voltage ou tension ou encore différence de potentiel. tous ces termes sont cependant équivalents. initialement, le neurone est inactif ou au repos et son potentiel de membrane est autour de -70mv. on appelle le potentiel durant cette période potentiel de repos . ensuite, le neurone produit une série de pics de potentiels que l on appelle des potentiels d action. les potentiels d action sont l expression électrique de nos influx nerveux. 10- -- 18- 19:la pompe échangeuse na/k fait continuellement sont travail, lentement mais sûrement, établissant les gradients chimiques pour les ions sodium (na+) et potassium (k+) (voir génie 101). les ions na+ sont concentrés à l extérieur du neurone, tandis que les ions k+ sont concentrés dans le neurone. le travail des pompes échangeuses d ions garde le potentiel pratiquement neutre (autour de zéro) et ne permet pas d établir un potentiel électrique à elles seules. cependant, puisque les canaux ioniques au k+ sont ouverts, quelques ions k+ sortent du neurone sous la poussée du gradient chimique des ions k+. cette sortie d ions k+ déséquilibre les charges électriques de chaque côté de la membrane. par conséquent, il y a plus de charges positives du côté externe du neurone que du côté interne. en mesurant avec des électrodes de chaque côté de la membrane, on a déterminé que le potentiel de repos était autour de -70mv. suite à l établissement du potentiel de membrane à une valeur négative, une autre force agit sur les ions k+. en effet, les charges négatives dans le neurone attirent les ions k+, tandis que les charges positives les repoussent. dit autrement, une force électrostatique attire les ions k+ vers le milieu interne du neurone. -70mv est le point d équilibre entre le gradient chimique et la force électrostatique pour les ions k+ ce qui explique l établissement du potentiel de repos à cette valeur. cependant, les ions na+ ont un léger effet qui dépolarise la membrane au repos parce que de rares canaux sodiques sont ouverts. le potentiel de repos est donc légèrement plus positif qu à l effet seul des canaux potassiques et des ions k+. 20-neurone at work : potentiel d action -- 29-conductances des canaux ioniques au sodium et au potassium en relation avec les étapes d un potentiel d action. 30:soudainement (en 2), un stimulus représenté par l étoile rouge et généralement produit par l action des synapses, dépolarise la membrane légèrement. si le potentiel de membrane atteint alors le potentiel de seuil, un potentiel d action est déclenché. le potentiel de seuil représente la limite minimale à laquelle suffisamment de canaux sodiques peuvent s ouvrir. l ouverture des canaux au na+ permet un influx important d ions na+ dans le neurone (canal en jaune). cet influx d ions chargés positivement change rapidement la polarité de la membrane vers des valeurs plus positives. la membrane se dépolarise. l entrée d ions na+ est forte parce que le gradient chimique des ions na+ (en jaune) et le gradient électrostatique (en noir) vont dans la même direction. l ouverture des canaux sodiques et l entrée d ions na+ agissent ensemble comme une réaction en chaîne (ou comme une rétroaction positive). plus de canaux sodiques s ouvrent, plus d ions na+ entrent et dépolarise la membrane qui active plus de canaux sodiques… 31- /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/18.TXT 2-la cellule musculaire lisse vasculaire (cmlv) 3: 2.1.1 couplage électromécanique : modification du potentiel de membrane 4- 5: 2.1.1.1 potentiel de membrane 6- 7:en fonction des territoires vasculaires, le potentiel de membrane des cellules musculaires lisses varie entre -45 et -70 mv (hirst et al., 1989 ; serebryakov et al., 1992). deux types de canaux ioniques interviennent dans la modulation du potentiel de membrane dans les cmlv : des canaux k+ et des canaux cl-, tous deux dépendant du ca2+. dans le cas d une augmentation de la concentration en ca2+, ces canaux sont activés. le canal chlore dépendant du ca2+ va provoquer une sortie de cl-, et donc une dépolarisation de la membrane plasmique. au contraire, l activation par le ca2+ des canaux potassiques dépendants du ca2+ provoque une sortie de k+ et donc une hyperpolarisation et par voie de conséquence une diminution du tonus vasculaire. 8- -- 10- 11:la modification du potentiel de membrane de 3 mv augmente (dépolarisation) ou diminue (hyperpolarisation) de deux fois l entrée de ca2+ par les canaux calciques voltage dépendants. les études pharmacologiques et électrophysiologiques ont montré qu il existe six types de canaux calciques voltage dépendants (ccvds) : les ccvds de type l, t, n, r, q et p (godfraind et govoni, 1995). dans les cmlv, deux types sont présents : le type l ( long-lasting ) et le type t ( transient ) (hurwitz, 1986 ; bean, 1989 ; pelzer et al., 1990 ; tsien et al., 1991). les canaux de type t sont activés par des dépolarisations moyennes (-30 mv) et sont inactivés rapidement (20 à 60 ms). les canaux de type l sont activés par de forte dépolarisation, à partir de –40mv, mais leur activation est complète à 0 mv, et ils sont inactivés moins rapidement que les canaux de type t (300 à 600 ms) (tsien et al., 1991 ; mcdonald et al., 1994). /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/PDF/19.TXT 6-mesures des paramètres physiologiques : après 15 et 30 jours d incubation, les cellules sont prélevées, centrifugées et lavées. le volume cellulaire, le ph interne et le 7:potentiel de membrane sont mesurés par un marquage radioactif (5-6-7). les concentrations en ions potassium sont mesurées par spectrophotométrie d absorption atomique après minéralisation sulfurique. les dosages des atp, adp et amp sont réalisés par hplc. 8-j0 j15 j30 -- 16-85 6,63±0,18 6,00±0,11 5,75±0,05 17:potentiel de membrane (mv) 18-bf -54±1 -31±8 -5±1 -- 42-- d une diminution du ph interne, 43:- d une diminution du potentiel de membrane qui tend à s annuler, 44-- d une augmentation du volume cellulaire, d une diminution de la concentration intracellulaire en potassium, -- 47-concentrations minimales en potassium, compatibles avec le maintient de la vie ont été 48:atteint. il est vraisemblable que la diminution du potentiel de membrane observée 49-corresponde à la sortie des ions k+. de même, l acidification observée résulte en partie -- 87-l objectif de cette étude est de caractériser l état vnc de c. jejuni par des mesures 88:du volume cellulaire, du ph interne, du potentiel de membrane, des concentrations intracellulaires en potassium et en atp, adp et amp. 89-tableau 1 90:volume cellulaire, ph interne, potentiel de membrane et concentration 91-intracellulaire en potassium mesurés chez 3 souches de c.jejuni (bf,79 et /cygdrive/d/Potencial/Fr/Pages-completes/membranne/20.TXT 3- 4:la différence de potentiel transmembranaire, ou potentiel de membrane, d une cellule animale est proche de -70mv, la face cytoplasmique étant chargée négativement par rapport à la face externe. le potentiel de membrane est le résultat de mouvements ioniques transmembranaires. ces mouvements sont la conséquence d une distribution inégale de part et d autre de la membrane des ions et macromolécules chargées (comme les glucides complexes, les nucléotides et les protéines). cette distribution est elle- même la conséquence de transports transmembranaires actifs avec une contribution majeure de l atpase na+/k+. 5- 6:dans un état repos c est le mouvement de k+ au travers de la membrane qui prédomine, parce qu il y a plus de canaux potassiques que de canaux sodiques ouverts. en conséquence, la valeur du potentiel de repos est essentiellement déterminée par le mouvement de k+. grâce à sa concentration intracellulaire très élevée, le k+ sort de la cellule en polarisant la face cytoplasmique négativement par rapport à la face externe. le potentiel ainsi créé s oppose au mouvement suivant de au travers de la membrane, c est-à-dire que le gradient électrochimique de k+ diminue. sans la présence de na+, le potentiel atteint la valeur de -90mv (potentiel d équilibre du potassium), valeur pour laquelle il y a équilibre entre les deux forces (gradient électrochimique du potassium nul). cependant, le potentiel de membrane créé par le k+, induit une augmentation considérable du gradient électrochimique du na+ ce qui provoque un flux entrant de na+ de plus en plus important. a un moment donné, inférieur à 1ms, il s installe un équilibre dynamique où il y autant de k+ qui sortent que de na+ qui entrent (courant net nul) : c est le potentiel de membrane de repos. 7- -- 13- 14:il est important de savoir que les flux ioniques responsables du potentiel de repos n impliquent que des quantités minimes (de l ordre de la picomole) par rapport aux concentrations ioniques de la cellule et son environnement (de l ordre de la millimole). a court terme, ces mouvements n ont pas d effets importants sur la concentration des ions, intra ou extracellulaire. en revanche, lorsqu on inhibe l atpase na+/k+ par de l ouabaïne, la cellule perd progressivement (plusieurs minutes) son potentiel de membrane et son volume augmente à la suite d un gain net en ions intracellulaires. une part considérable (25 à 50%) de l atp cellulaire disponible sert à maintenir les gradients de concentration d ions à travers la membrane plasmique et les membranes intracellulaires.